Citologías

 

Extención citológica

 

Metodo de montaje para la conservación de extensiones

Obtención de muestras

Tecnicas de tinción

 

 CITOLOGÍAS

El objetivo básico de la Citología es diferenciar entre una población celular normal, una respuesta citológica inflamatoria y una población celular neoplásica. Esta información que es obtenida de una manera rápida y poco agresiva es en muchos casos suficiente y valiosa permitiendonos establecer un diagnóstico y pronóstico preliminar del proceso, dar una pauta en relación a los posibles tratamientos y determinar cuales son los procedimientos diagnósticos a realizar seguidamente (cultivo microbiológico, test serológicos, histopatología, etc).

La citología nunca debe ser considerada como un sustituto del estudio histopatológico especialmente en procesos de tipo neoplásico. Así, dificilmente en el analisis citológico vamos a apreciar patrones de crecimiento que en muchas ocasiones definen algún tipo de tumor y nunca podremos apreciar la existencia de émbolos tumorales ni establecer el tipo de crecimiento expansivo o infiltrativo de la neoplasia que son criterios fundamentales para determinar el grado de malignidad de un tumor.

Para establecer un buen diagnóstico citológico es fundamental realizar un historial clínico lo más completo posible que incluya los datos del animal (especie, raza, sexo, edad, etc) localización y fecha de aparición de la lesión, color y consistencia en caso de lesiones externas, tamaño y velocidad de crecimiento, etc. Todos estos datos son orientativos y en muchos casos definitivos para que, junto al estudio citológico, se establezca un diagnóstico definitivo del proceso patológico.

 

OBTENCIÓN DE MUESTRAS

Un porcentaje elevado del éxito en al análisis citológico depende de una buena recolección de muestras y en una correcta realización de la extensión citológica.

Existen diferentes técnicas de recolección cuya elección dependerá de la localización corporal, el tipo de lesión que queremos analizar y las características del paciente. Entre las técnicas más usuales se citan:

-Impresión o impronta: en lesiones externas, biopsias por escisión (tanto para piezas de resección quirúrgica como muestras de necropsia) o para lesiones que drenan. Previamente a la toma de muestra con el porta por contacto deberemos limpiar la zona y eliminar sangre, costras o exudados. Es una técnica rápida , sencilla y muy poco agresiva pero tiene el inconveniente de que la muestra en ocasiones es escasa y al ser muy superficial puede contener contaminación. Para procesos neoplásicos no es la técnica más indicada ya que a veces sólamente refleja infección bacteriana secundaria o inflamación superficial quedando las células tumorales en profundidad.

-Raspado: en lesiones externas, biopsias por escisión (tanto para piezas de resección quirúrgica como muestras de necropsia), sobre superficies mucosas y lesiones donde no se puede realizar una impronta. Se debe limpiar la zona y eliminar sangre, costras o exudados y posteriormente realizar el raspado superficial de la masa con un escarpelo romo, una hoja de bisturí o con el borde de un portaobjetos extendiéndolo posteriormente sobre otro portaobjetos cuidadosamente en una delgada capa. Las ventajas e inconvenientes de esta técnica son similares a las descritas para la imprinta.

-Con hisopo o escobillón: solo está indicada en aquellos casos en los que no se puede realizar una impronta, raspado o aspirado con aguja fina debido a su dificil acceso como por ejemplo en trayectos fistulosos. También está indicada para estudios citológicos sobre superficies mucosas (vaginal, conjuntival, traqueal, etc) y para las otitis.

-Aspiración con aguja fina (AAF): en derrames y recolección de diferentes líquidos corporales (ascítico, sinovial, cefalorraquídeo, etc), lesiones externas de tipo quístico o de masas sólidas, punción ganglionar y de médula ósea y de órganos y masas internas. Se requiere una aguja del 22-25 G y una jeringuilla de 10-20 cc.

En el caso de AAF de una masa sólida ésta debe ser identificada e inmobilizada, rasurando y limpiando la superficie con agua jabonosa y desinfectando la zona con alcohol. Se introduce la aguja en la masa y se aplica una presión negativa en la jeringuilla cambiando la dirección de la aguja para recolectar muestra de diferentes zonas internas de la lesión. A continuación se libera con cuidado la presión negativa de la jeringuilla quedando la muestra a recolectar en el interior de la aguja. Se desclava la aguja y se separa de la jeringuilla. Por último, acoplándo una jeringuilla a la que hemos introducido previamente aire se expulsa el contenido de la aguja sobre un portaobjetos.

 

 

REALIZACIÓN DE LA EXTENSIÓN CITOLÓGICA

Existen numerosos métodos para la realización de una extensión citológica sobre un portaobjetos, siendo la más empleada el método por deslizamiento. Esta técnica consiste en extender la muestra recolectada previamente sobre un portaobjetos colocando perpendicularmente sobre ella la superficie plana de otro portaobjetos que se deslizará suavemente realizando una presión ligera para impedir que se rompan las células en el arrastre. Otras técnicas alternativas como mediante giro, en estrella, etc y el empleo de métodos combinados son más difíciles de realizar.

En el caso de líquidos se aconseja que la extensión se realice inmediatamente después de la toma de la muestra. El método para realizar la extensión es similar al del frotis sanguíneo, es decir, deslizando unas gotas de la muestra sobre un portaobjetos mediante el borde romo de otro portaobjetos con una inclinación de 30-40º. Para conseguir una zona de mayor concentración celular, tras deslizar el líquido tres cuartas partes de la longitud del porta, nos detenemos unos instantes y levantamos perpendicularmente el borde del portaobjetos con el que hemos realizado la extensión. Para los líquidos también se puede utilizar el método de deslizamiento descrito anteriormente.

En caso de líquidos poco densos o poco viscosos se puede concentrar el fluido por centrifugación durante 5 minutos a 1000-1500 rpm. El sedimento se resuspende en unas pocas gotas del sobrenadante eliminando el resto que puede ser utilizado para determinación de proteinas, etc.

 

TÉCNICAS DE TINCIÓN

Tras la realización de la extensión sobre el portaobjetos se dejará fijar al aire. Existen numerosas técnicas de tinción para citología. En general se clasifican en dos tipos: las más utilizadas por su simplicidad y rapidez son las técnicas Romanoswky entre las que se encuentran el Giemsa, tinción de Wrighty el Diff-Quick. El otro tipo de tinciones incluyen las técnicas de Papanicolaou y sus derivados que consiguen detectar cambios nucleares y nucleolares con excelente detalle pero no consiguen calidad para los cambios citoplasmáticos y no sirven para demostrar bacterias y otros agentes infecciosos.

-Tinción de Giemsa:

-Fijación con metanol durante 5 minutos.

-Escurrir el metanol y dejar secar al aire.

-Tinción durante 20-30 minutos con una solución de 1gota de solución madre de Giemsa por cada ml de agua destilada (siguiendo esta pauta se hará la cantidad de solución hija de Giemsa que se necesite en ese momento preparando 4 ml de solución final por cada extensión).

-Lavar con agua y secar la preparación al aire.

-Tinción rápida Diff-Quick (Hartman Leddon Co) y tinción HEMACOLOR (Merck):

-Realizar 4-5 inmersiones en cada uno de las soluciones I, II y III.

-Lavar con agua destilada y dejar secar al aire.

 

 

METODO DE MONTAJE PARA LA CONSERVACIÓN DE EXTENSIONES

Con el paso del tiempo, e independientemente del método de tinción que utilicemos, la calidad e intensidad del colorido de la tinción se va perdiendo. Para que esto no suceda mediante un último paso podemos conservar nuestras preparaciones prácticamente de manera indefinida mediante el montaje de las mismas de forma similar al montaje de los cortes de tejidos para estudio histopatológico.

Este último paso se hace después de teñir las extensiones con el colorante, lavarlas con agua y dejarlas secar al aire. Los pasos a seguir son:

-Deshidratar con alcohol absoluto durante 30 segundos.

-Escurrir el alcohol y cubrir la preparación con xilol durante 30 segundos.

-Montar con medio de montaje para microscopía (DepeX, Eukitt, etc): colocar varias gotas del medio de montaje en un cubreobjetos de 24x50 mm y colocar sobre ella la extensión una vez escurrido el xilol dejándolo asentar durante un par de minutos. Durante estos pasos es importante que no le caiga agua a las preparaciones para que no se rehidraten.

Si queremos observar las preparaciones con el objetivo de 100x colocaremos la gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos. Según nuestra experiencia, la calidad de detalle es similar o incluso superior a la apreciada sin montar la extensión. Además es mucho más fácil de limpiar ya que limpiamos la superficie externa del cubreobjetos sin arrastrar las células.